三、分离
目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：
纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。
变色圈法：直接用显色剂或指示剂。
生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。
抑制圈法：琼脂块培养法。
四、筛选
即进行生产性能测定，确定适合生产要求菌种。
一般初筛、复筛、再复筛，少数几株进行全面考察。
筛选时培养条件确定是关键，培养基组成、通风、pH、温度等应根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件及前人的工作进行综合考察，慎重选定。
初筛一株一瓶，取其中10-20%复筛，一株3瓶，直至最后3-5株，广泛考察。
(二)自发突变与育种
一、生产育种
二、定向育种
用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老育种方法。
近年发展代谢类似物的梯度培养皿法。
(三)诱变育种
利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科研之用。
基本工作步骤：
基本步骤
原种 (出发菌株) → 纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液
→诱变处理 → 平板分离 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及扩大试验
(活菌计数) (计数) (变异率)(初筛) (复筛) (再复筛)
一、出发菌株的选择
用作出发菌株有：野生型菌株;生产菌株;经过诱变的菌株。
一般要求生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。
二、菌悬液制备
一般采用单孢子或单细胞悬液。
诱变剂一般只作用与DNA的一条链，发生变异无法反映在当代表型上，只有经过DNA复制和细胞分裂后，才会使表型发生变异，此即表型延迟。
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、菌悬液介质(生理盐水或缓冲液)。
三、诱变处理
1、常用诱变剂：
物理诱变剂：紫外线(UV)、X射线、r射线、快中子(0.2-10Mev)。
化学诱变剂：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亚硝基胍NTG。
总结表
2、诱变剂量：
诱变剂作用：提高突变率;扩大产量变异幅度;使变异朝正变或负变方向移动。
凡是在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。图8-21
3、处理方法：
采用复合处理，包括诱变剂先后使用，同时使用和重复使用，提高效果。
表8-8
四、变异菌株的分离和筛选
诱变处理后一般要经过后培养和变异株筛选。
一般将筛选分为初筛和复筛。
初筛重点在于分离培养尽可能多菌株，采用预先设计的相同培养条件，以量为主，准确性其次，减少漏筛机会。
复筛以质为主，反复多次。
高效筛选方案：
寻找利用和创造形态、生理与生产性状间的相关性。
筛选抗生素生产菌时，可采用琼脂块培养法：图8-22
(四)营养缺陷型筛选
基本培养基(MM，[-])：凡能满足某一菌种野生型和原养型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。
完全培养基(CM，[+])：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满足该微生物各种营养缺陷型要求。
补充培养基(SM，[X])：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。
营养缺陷型表示：所要求的营养物的头三个字母表示，如bio-，对应的野生型以bio+表示。
一般步骤：
1、诱变处理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法。
3、检出缺陷型：方法有
1)夹层培养法：图8-23。
2)限量补充培养法：含微量蛋白胨(0.01%)的[一]上。
3)逐个检出法：分别接种到[-]和[+]上。
4)影印接种法：[+]培养，影印至[-]上。
4、鉴定缺陷型：
1)生长谱法：缺陷型斜面培养后，制成菌悬液涂布于[-]上，平板上划成不同区域，分别加上一种所需测验的营养物，培养观察。
2)组合补充培养基法：菌株较多时用。
营养缺陷型应用
1、标记菌种：代谢途径、杂交、基因重组中。
2、生物测定用菌
3、生产菌株：前体积累。
(五)抗性突变株筛选
1、一次性筛选：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株。
2、阶梯性筛选：使用浓度梯度与某一空间或时间。
空间-梯度培养皿法：图8-18。
时间-类似于驯化。
4节:基因重组与杂交育种
杂交hybridization：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传物质交换重新组合成新的性状。
基因重组gene
recombination：两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式。
第四章：微生物生长
生长：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。
繁殖：单细胞-由于细胞分裂引起个体数目的增加。
多细胞-通过无性或有性孢子使个体数目增加的过程。
发育：适合条件下，生长与繁殖始终是交替进行的，从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程称为发育。
1节：微生物的发育周期
一、概念
发育周期、单细胞微生物、丝状真菌
二、发育周期中细胞学上变化
1、细胞壁与质膜的延伸
质膜合成位点在赤道带，细胞壁生长也定位在赤道区，并具有种的特异性。
2、DNA的复制
1)单向复制 John Cairns：E. Coli作材料，放射自显影技术。染色体从起始点开始，反时针旋转一周完成。
2)双向复制 Hiroshi Yoshikawa：不只按一个方向复制，起点与终点不重合。
3)滚环模型：不对称复制。一股线状，一股环状复制。
真核微生物复制有多个位点，都是双向。
3、发育循环中基因的表达
DNA的复制与细胞分裂是协调的。细胞分裂总是发生在DNA复制后的一定时间内。抑制DNA合成的各种化学处理或突变也抑制细胞分裂。细菌DNA复制需DNA起始蛋白作用。
E. coli 细胞分裂总是发生在DNA复制完成后大约20分钟，而DNA复制需40分钟，这样世代时间应是60分钟，但…...
三、细胞分化现象
在某些微生物的发育循环中，一个或一群细胞会从一种形态与功能转变为另一种形态与功能，此称细胞分化或形态发生。
2节：微生物纯培养的生长
一、纯培养的分离方法 表
二、生长测定(适用、注意事项)
直接计数法(全数)
间接计数法(活菌数)
测细胞物质量
三、细菌纯培养群体生长规律
将少量纯培养接种到一恒定体积的新鲜液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定细菌含量，以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标，得繁殖曲线，对单细胞而言，又称生长曲线。
根据生长速率不同，分为几个时期。
(一)延迟期 lag phase(停滞期、调整期) | 
